1. 用途

RIDASCREEN® Zearalenon 玉米赤霉烯酮檢測(cè)試劑盒，采用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫法定

量測(cè)定谷物、飼料、啤酒、血清和尿液中殘留的玉米赤霉烯酮含量。

2. 概要

玉米赤霉烯酮是由鐮刀菌類的真菌形成。它是一種植物性激素，并具雌激素性特

征。從而導(dǎo)致動(dòng)物生育能力紊亂或降低，臨床癥狀表現(xiàn)為雌激素過多。此類疾病不

僅常見于肉豬，也出現(xiàn)在牛、馬、羊等牲畜上。而關(guān)于攝入霉菌毒素的植物或動(dòng)物

器官等食品對(duì)人體導(dǎo)致的潛在健康危害更是頻頻被討論的焦點(diǎn)。

3. 檢測(cè)原理

檢測(cè)的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有特殊的玉米赤霉烯酮抗體。加入標(biāo)準(zhǔn)

品、樣品溶液和酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮（酶連接物）。游離的玉米赤霉烯酮和酶連

接物競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)（競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫分析）。沒有結(jié)合的酶連接物在洗滌步驟

中被除去。

在孔中加入底物（過氧化脲）和發(fā)色劑（四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯），結(jié)合的酶連接物

將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色。加入反應(yīng)終止液后顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在 450

nm 處測(cè)量，吸光度值與樣品中的玉米赤霉烯酮濃度成反比。

4. 試劑盒組份

每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行 96 次檢測(cè)（包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定）。盒中的組份如下：

1 x 96 孔微孔板（12 條每條 8 孔）

    包被有針對(duì)玉米赤霉烯酮的抗體

6 x 標(biāo)準(zhǔn)品（每瓶 1.3 ml）

    0 ppt （零標(biāo)準(zhǔn)品），50 ppt，150 ppt，450 ppt，1350 ppt，4050 ppt

    玉米赤霉烯酮水溶液

1 x 酶連接物（0.7 ml） .......................................................................... 紅色瓶蓋

    過氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮

    濃縮液

1 x 底物（7 ml） .................................................................................... 綠色瓶蓋

    含有過氧化脲

1 x 發(fā)色劑（7 ml）................................................................................. 藍(lán)色瓶蓋

    含有四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯

1 x 反應(yīng)終止液（14 ml）........................................................................ 黃色瓶蓋

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    含 1 N 的硫酸

1 x 緩沖液 1（50 ml）............................................................................ 白色瓶蓋

    樣品和酶連接物稀釋緩沖液

5. 另需的試劑和設(shè)備

5.1. 設(shè)備：

− 微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）

− 實(shí)驗(yàn)用粉碎機(jī)和或糧食碾磨機(jī)

− 振蕩器

− 用于樣品處理：漏斗和玻璃長頸瓶（100 ml）

− 濾紙：Whatman No. 1 或者類似

− 離心機(jī)

− 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或者其他蒸發(fā)設(shè)備

− 巴氏吸液管

− 刻度移液管

− 20 µl - 200 µl 和 200 - 1000 µl 微量移液管

5.2. 試劑

− 甲醇

其他用于處理血清或尿液的必要試劑：

− Glucuronidase/Arylsulfatase aus Helix pomatia （Merck, Art. Nr.: 4114） 來源于羅

  曼蝸牛的葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（Merck 公司，訂貨號(hào)：4114）

− RIDA® C18 column（訂貨號(hào)：R2002）

− 50 mM 乙酸鈉緩沖液，pH 4.8

− 20 mM Tris 緩沖液，pH 8.5 / 甲醇（80/20）

6. 操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)

標(biāo)準(zhǔn)品中含有玉米赤霉烯酮，應(yīng)特別小心。避免皮膚接觸（使用手套）。

玻璃器具和有毒溶液用次氯酸鈉溶液（10 % （v/v））浸泡消毒夜（用 HCl 調(diào)節(jié)

溶液 PH 值為 7） 。

反應(yīng)終止液為 1 N 硫酸（R36/38， S2-26）。

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7. 儲(chǔ)存條件

保存試劑盒于 2 - 8 °C，不要冷凍。

將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封儲(chǔ)存于 2 - 8 °C

條件下。

玉米赤霉烯酮對(duì)光敏感，因此標(biāo)準(zhǔn)品要避免直接暴露在光線下。

無色底物/發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

對(duì)過了有效期（見試劑盒標(biāo)簽）的試劑盒不再提供任何質(zhì)量保證。

不能交叉使用不同批號(hào)的盒中試劑。

8. 試劑變質(zhì)的跡象

− 底物/發(fā)色劑在使用前發(fā)現(xiàn)顏色變藍(lán)

− 零標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值小于 0.6 （E450 nm < 0.6）

9. 樣品處理

樣品應(yīng)當(dāng)避光冷藏保存。

9.1. 谷物和飼料樣品

對(duì)采集的代表性樣品用實(shí)驗(yàn)用粉碎機(jī)粉碎并充分混合

− 稱取 5 g 粉碎后的樣品，加入 25 ml 甲醇/水（70/30）溶液*

− 用力振蕩 3 min（手動(dòng)或借助振蕩器）

− 提取物離心：10 min / 3500 g /室溫（20 - 25 °C）或者使用 Whatman No. 1 濾

  紙過濾

− 上清液或者濾液用樣品稀釋緩沖液（緩沖液 1）按照 1:7 （1 + 6） 的比例稀釋（例

  如：100 µl 上清液或?yàn)V液 + 600 µl 緩沖液 1）

− 每孔取 50 µl 稀釋后的上清液或稀釋后濾液進(jìn)行檢測(cè)

*） 樣品的用量可以適當(dāng)?shù)脑龃?，但是甲?水溶液的用量也應(yīng)同比例增加，比如

  10 g 樣品中加入 50 ml 70 % 甲醇/水溶液（70/30）

備注：

此甲醇提取物（上清液或?yàn)V液）可以在冰箱中（2 - 8 °C）保存 2 星期，可以在冰

柜中（-20 °C）保存 2 個(gè)月。應(yīng)保存于棕色玻璃瓶中并儲(chǔ)存于暗處。

如果玉米赤霉烯酮的濃度預(yù)計(jì)較高，必須用樣品稀釋緩沖液（緩沖液 1）繼續(xù)稀

釋。

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9.2. 啤酒樣品

− 去除足量啤酒樣品中的氣體（繼續(xù)減少碳酸的含量，直到肉眼不能看見氣泡為

  止，例如通過攪拌或者過濾）

− 去除氣體的啤酒樣品用樣品稀釋緩沖液（緩沖液 1）稀釋，稀釋比例為 1：5（1

  + 4）（例如：100 µl 樣品 + 400 µl 緩沖液 1）

− 每孔 50 µl 進(jìn)行檢測(cè)

備注：

對(duì)于有渾濁的啤酒樣品（例如酵母小麥啤酒），在去除氣體后必須對(duì)樣品進(jìn)行無菌

過濾，然后再進(jìn)行檢測(cè)！

9.3.血清和尿液

僅針對(duì)尿液的處理：

− 取 0.5 ml 尿液樣品用 50 mM 乙酸鈉緩沖液，pH 4.8 稀釋

− 加入 8 µl 羅曼蝸牛葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶

− 在 37 °C 條件下孵育 3 小時(shí)

使用 RIDA® C18 column （訂貨號(hào)：R2002）對(duì) 3.5 ml 水解尿或血清（未處理）按

照如下步驟純化：

− 滴速為 1 滴/秒

− 使用 3 ml 甲醇（100 %）洗滌層析柱

− 使用 2 ml 20 mM Tris 緩沖液，pH 8.5 / 甲醇（80/20）平衡層析柱

− 水解尿或者 0.5 ml 血清上柱

− 使用 2 ml 20 mM Tris 緩沖液，pH 8.5 / 甲醇（80/20）洗脫

− 使用 3 ml 甲醇溶液（40 %）洗脫

− 壓入或吸出空氣對(duì)層析柱進(jìn)行干燥（1 分鐘）

− 使用 1 ml 甲醇溶液（80 %）緩慢洗脫樣品（15 滴每分鐘）

− 蒸發(fā)洗脫液，zui高溫度 60 °C（盡量在通風(fēng)廚中弱氮?dú)饬鳁l件下）

− 干燥殘留物溶解于 50 µl 甲醇中，加入樣品稀釋緩沖液 450 µl（緩沖液 1）并充

  分混合

− 每孔 50 µl 進(jìn)行檢測(cè)

備注：

可根據(jù)需求提供肉類和奶類樣品的處理方法。

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10. 檢測(cè)步驟

10.1. 檢測(cè)前的準(zhǔn)備

使用之前將所有試劑回溫至室溫（20 - 25 °C）。

玉米赤霉烯酮酶連接物（紅色瓶蓋瓶子）為濃縮液。由于稀釋的酶連接物的弱穩(wěn)定

性，所以只稀釋實(shí)際需用量的酶連接物。 在吸取濃縮液之前，要仔細(xì)地輕輕振搖。

用緩沖液 1（白色瓶蓋的瓶子）以 1:11（1 + 10）的比例稀釋酶連接物濃縮液（例

如：200 µl 濃縮液 + 2.0 ml 緩沖液，足夠 4 個(gè)微孔板條用）。

10.2. 檢測(cè)操作

仔細(xì)進(jìn)行洗板的操作非常重要。在使用中不要讓微孔出現(xiàn)干燥。

1. 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品檢測(cè)所需數(shù)量的孔條插入微孔板架，均做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，

   記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。

2. 將 50 µl 標(biāo)準(zhǔn)品及處理好的樣品溶液加到相應(yīng)的微孔中，均做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

3. 向每一個(gè)微孔中加入 50 µl 稀釋后的酶連接物溶液，充分混合后在室溫（20 -

   25 °C）條件下暗處孵育 2 小時(shí)。

4. 倒出孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打 3 次）以保證完

   全除去孔中的液體。加入 250 µl 蒸餾水洗滌微孔。上述操作重復(fù)進(jìn)行兩遍。

5. 向每一個(gè)微孔中加入 50 µl 底物和 50 µl 發(fā)色劑，充分混合后在室溫（20 - 25

   °C）條件下暗處孵育 30 分鐘。

6. 向每一個(gè)微孔中加入 100 µl 反應(yīng)終止液，充分混合。在加入反應(yīng)終止液后 30

   分鐘內(nèi)于 450 nm 處測(cè)量吸光度值。

11. 結(jié)果評(píng)估

請(qǐng)使用 R-Biopharm 德國拜發(fā)公司專門為 RIDASCREEN® 系列產(chǎn)品設(shè)計(jì)的應(yīng)用軟件

RIDA® SOFT Win（訂貨號(hào)：Z9999）來進(jìn)行結(jié)果分析。

對(duì)單次檢測(cè)建議使用Logit/log 曲線進(jìn)行結(jié)果分析，對(duì)兩次或多次平行檢測(cè)應(yīng)該使用

Cubic Spline 曲線進(jìn)行結(jié)果分析。

關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線請(qǐng)參看試劑盒中附帶的質(zhì)保證書。

以下是沒有使用軟件的計(jì)算方法：

標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值（或樣品）

-----------------------------x 100 = % 吸光度比值

零標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值

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吸光度值以百分比表示，因此零標(biāo)準(zhǔn)品等同于 100 %。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的比值，并

繪成一個(gè)與玉米赤霉烯酮濃度（ng/kg）相關(guān)的半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)的曲線圖。根據(jù)每

個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的吸光度值，從校正曲線中讀出樣品中玉米赤霉烯酮的濃度

（ng/kg）。

為了獲得樣品中玉米赤霉烯酮的實(shí)際濃度 ng/kg，從校正曲線上讀出的濃度值必須

乘以相對(duì)應(yīng)的樣品稀釋倍數(shù)。按照說明書中給出的方法進(jìn)行操作，樣品稀釋倍數(shù)

為：

谷物和飼料樣品 .......................................... 35

啤酒樣品 ....................................................... 5

尿液和血清樣品 ............................................ 1

以上信息是基于我們現(xiàn)有知識(shí)的基礎(chǔ)上對(duì)我們的產(chǎn)品及其相關(guān)應(yīng)用的說明。而

并非對(duì)產(chǎn)品的任何特定性能或特定使用目的進(jìn)行擔(dān)保。R-Biopharm 德國拜發(fā)

公司不承擔(dān)除試劑基本品質(zhì)之外的任何責(zé)任。除因產(chǎn)品使用而造成的直接或間

接損壞及損失外，其它有缺陷的試劑盒可退換。

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